Genetic analysis in various razor shell species of family pharidae, with focus on atlantic "Ensis"

[Resumen] En esta tesis se ha realizado un estudio genético de un grupo de bivalvos marinos de la familia Pharidae Adams y Adams, 1858, y principalmente de las navajas del género Ensis Schumacher, 1817. El estudio se desarrolla dentro de las áreas de la genética evolutiva, genética poblacional, citogenética, delimitación de especies y DNA barcoding. Las especies de navaja utilizadas fueron seleccionadas debido al interés comercial que muchas especies de Ensis tienen en varias regiones de Europa y América, incluyéndose también el litoral de Galicia. Además, su distribución a ambos lados del Atlántico y en zonas de la costa pacífica de los Estados Unidos, El Perú y Chile hace que sean de interés en estudios filogeográficos. Por último, los problemas en la identificación de las especies a partir de caracteres morfológicos hicieron de este grupo de organismos un buen candidato para el desarrollo de herramientas moleculares y citogenéticas que complementasen los estudios de morfometría. La metodología utilizada varía en cierto modo a lo largo de cada uno de los capítulos que conforman los resultados de la tesis, aunque puede resumirse como sigue: en el capítulo 4.1.1, el ADN ribosomal 5S y el ADN pequeño nuclear U1, que conforman familias génicas de copia múltiple, fueron estudiados mediante un procedimiento de amplificación por PCR, clonación y secuenciación. Todas estas secuencias obtenidas experimentalmente en el laboratorio fueron posteriormente analizadas mediante numerosas herramientas bioinformáticas. En el capítulo 4.1.2, en el que se estudiaron 97 especies de metazoos, la metodología utilizada fue diferente, ya que se utilizaron bases de datos de proyectos genoma y herramientas bioinformáticas de alta capacidad, algunas de las cuales fueron diseñadas expresamente para este trabajo. En el capítulo 4.2 se realizó un estudio citogenético en el que se utilizaron técnicas de microscopía en campo claro y fluorescente, así como la hibridación de sondas fluorescentes sobre los cromosomas de las navajas, que fueron utilizadas como marcadores cromosómicos. Se realizó también la medición y ordenación de los cromosomas por tamaño e índice centromérico, para elaborar los cariotipos. Por último, en los capítulos 4.3 y 4.4 se utilizaron como marcadores moleculares diferentes regiones de los genomas nuclear y mitocondrial, que han sido amplificadas mediante PCR, siendo a veces clonadas, previamente a su secuenciación. Estos marcadores moleculares son fragmentos de los genes mitocondriales citocromo oxidasa subunidad I y ADN ribosomal 16S; fragmentos de los genes nucleares adenina nucleótido translocasa y ADN ribosomal 18S; y la región nuclear que contiene los espaciadores ribosomales ITS1 e ITS2, y el gen ribosomal 5.8S. Algunos de ellos se han empleado solo a nivel poblacional, algunos solo a nivel de especie, mientras que otros se han empleado a ambos niveles. En el capítulo 4.1.1 se estudió el ligamiento entre el ADN ribosomal 5S y el ADN nuclear pequeño U1. Se describieron unidades de ligamiento entre ambas familias multigénicas en 10 especies (de cuatro géneros diferentes) de la familia Pharidae. Se obtuvo un número de clones que contenían repeticiones parciales o completas de ambos genes, en las que las regiones codificantes mostraron la misma orientación. Se obtuvo una completa colección de clones de ADN ribosomal 5S de varias especies de navajas, tanto ligados como no ligados al ADN nuclear pequeño U1. También se predijo la estructura secundaria de las regiones codificantes, y se caracterizó los elementos conservados de las regiones aguas arriba y aguas abajo de las mismas. El análisis de los espaciadores no transcritos (NTS) del ADN ribosomal 5S mostró que algunos de ellos estaban evolutivamente más relacionados con NTS de otras especies que con aquellos de la misma, sugiriendo polimorfismo ancestral y evolución a largo plazo mediante el proceso de birth-and-death. La conservación nucleotídica dentro de las regiones funcionales sugirió que la selección purificadora, además de los entrecruzamientos desiguales y las conversiones génicas, estuvieron implicados en la evolución de estas familias multigénicas. Considerando este estudio y otros previos, se discutieron los posibles mecanismos mediante los cuales ambas familias multigénicas han podido establecerse en unidades de ligamiento en el linaje de los Pharidae. La razón por la que el ADN ribosomal 5S se encuentra a menudo ligado a otras familias multigénicas parece ser el resultado de procesos estocásticos dentro de los genomas en el que su alto número de copia sería determinante. En el capítulo 4.1.2 se amplió el estudio anterior a 97 especies de metazoos, cuyos genomas estaban secuenciados y disponibles en bases de datos internacionales. Se analizaron y compararon sistemáticamente secuencias de ADN ribosomal 5S en especies de los principales clados de metazoos, usando métodos bioinformáticos. Tras haber realizado un filtrado de las secuencias candidatas, se obtuvieron 12766 copias putativamente funcionales que nos permitieron identificar algunas características generales del ADN ribosomal 5S de los animales. También se muestra que cada especie de mamífero analizada tiene una copia altamente conservada de ADN ribosomal 5S (que denominamos housekeeping) así como muchas otras copias más variables. Se analizó en detalle los NTS, la organización de esta familia multigénica en el genoma y su evolución. Nuestros resultados confirmaron la existencia de copias parálogas en 58 genomas. También fue evidente una organización flexible dentro del genoma de los animales. La existencia de agrupaciones heterogéneas de copias de ADN ribosomal 5S (compuestas de regiones codificantes similares y de NTS divergentes) en muchas especies apoya la hipótesis de un intercambio de ADN ribosomal 5S de un locus a otro del genoma. Además, obtuvimos un análisis detallado del grado de conservación evolutiva de las regiones promotoras internas, aguas arriba y aguas abajo en animales. Por último, describimos un método estadístico para analizar el ligamiento entre familias multigénicas codificadoras de ARN, que sin embargo no obtuvo ningún resultado de ligamiento estable entre el ADN ribosomal 5S y otras familias a lo largo de la evolución de los metazoos. En el siguiente capítulo (4.2) se realizó un estudio citogenético de la navaja europea Ensis minor (Chenu, 1843) y de la americana E. directus (Conrad, 1843). Se vio que ambas tienen un número cromosómico diploide de 38 y notables diferencias cariotípicas. E. minor tiene cuatro pares de cromosomas metacéntricos, uno metacéntrico-submetacéntrico, cinco submetacéntricos, uno subtelocéntrico y ocho telocéntricos. En cambio E. directus tiene tres pares metacéntricos, dos metacéntricos-submetacéntricos, seis submetacéntricos, seis subtelocéntricos y dos telocéntricos. La hibridación in situ fluorescente usando una sonda de genes ribosomales mayores localizó estos genes en un par submetacéntrico en ambas especies. La hibridación con ADN ribosomal 5S produjo una señal cromosómica débil en E. minor y ninguna en E. directus, apoyando una organización más dispersa de esta familia multigénica, comparada con la de los genes ribosomales mayores. La sonda telomérica de vertebrados (TTAGGG)n hibridó en ambos telómeros de cada cromosoma, sin señales intersticiales. Además, en este trabajo se realizó un estudio cariológico comparado de las cuatro Ensis analizadas hasta la fecha, las europeas E. minor, E. siliqua (Linné, 1758) y E. magnus Schumacher, 1817, y la americana E. directus. Las especies europeas mostraron más similitudes entre ellas que con E. directus. Además, se encontraron diferencias cariotípicas claras entre las especies morfológicamente similares E. minor y E. siliqua, en el número de pares cromosómicos telocéntricos y subtelocéntricos. En el capítulo 4.3 obtuvimos los niveles de variación genética actual de poblaciones de la navaja E. directus (Mollusca: Bivalvia: Pharidae) en los rangos de distribución nativo (América del Norte) e introducido (Europa) usando secuencias nucleares y mitocondriales. Esperábamos menor variación en el rango de distribución introducido, sobre todo considerando los frecuentes episodios de mortalidad en masa observados en Europa desde la introducción de la especie en 1978. Sin embargo, encontramos mayor variación en Europa. En este trabajo los resultados se comentaron a la luz de la posible influencia de incrementos o reducciones temporales de la variación genética, del efecto limitado de la deriva genética aleatoria y de posibles introducciones múltiples. Curiosamente, la hipótesis de las introducciones múltiples contrasta con la colonización gradual de la costa europea por parte de E. directus, pero es apoyada por la intensidad del tráfico transoceánico en el Atlántico. Por último, evidencias genéticas y morfométricas apoyaron claramente que los individuos de una población analizada de Terranova (Canadá) pertenecían a una especie nueva, desconocida hasta la fecha. Esta nueva Ensis se describió formalmente en este capítulo y fue denominada E. terranovensis n.sp. En el último capítulo (4.4) se realizó un trabajo de delimitación de especies y DNA barcoding en las Ensis del Atlántico, en el que se estudió si las morfoespecies actualmente descritas eran linajes evolutivos diferentes. En este trabajo estudiamos 109 especímenes pertenecientes a nueve especies de Ensis (todas las especies actuales del Atlántico) y en ellas analizamos la variación nucleotídica en cuatro regiones nucleares y en dos regiones mitocondriales. Los análisis filogenéticos realizados apoyan la monofilia recíproca de estas especies a cada lado del océano Atlántico. En Europa se encontraron cuatro linajes claramente diferenciados, que se correspondieron con las especies E. magnus, E. ensis (Linné, 1758), E. minor y E. siliqua, demostrándose, además, que E. minor y E. siliqua conviven en la costa NO de la Península Ibérica. Un grado de divergencia bastante relevante se apreció entre individuos de E. macha (Molina, 1792) muestreados en Chile y en Argentina, lo cual sugiere especiación incipiente. Además, se confirmó la presencia de E. directus al norte de Florida. De entre las regiones genómicas analizadas, se sugiere el fragmento de la citocromo oxidasa subunidad I para ser utilizada en identificación mediante DNA barcoding. Las contribuciones más relevantes de esta tesis son las siguientes: Se demostró que existen copias de ADN ribosomal 5S ligadas a copias de ADN pequeño nuclear U1 en los genomas de al menos 10 especies de la familia Pharidae, de cuatro géneros diferentes. Además de caracterizar, a nivel nucleotídico, ambas familias multigénicas, las secuencias obtenidas del ADN pequeño nuclear U1 son las primeras en la Clase Bivalvia. Se caracterizó por vez primera la diversidad del ADN ribosomal 5S en una escala evolutiva amplia, es decir, en 97 especies de metazoos. Se caracterizaron las especies E. minor y E. directus a nivel citogenético, obteniéndose conclusiones aplicadas a la taxonomía de estas especies, y a la organización genómica del ADN ribosomal 5S y de los genes ribosomales mayores. Se estudió la variación genética de poblaciones de E. directus en los rangos de distribución nativo e introducido, y se descrubrió y describió una nueva especie en Terranova, Canadá a la que se le llamó E. terranovensis. Se clarificó el estatus taxonómico de las especies actuales de Ensis en el Atlántico, y se definió que la región COI es adecuada para la identificación de estas especies mediante DNA barcoding

Long-term evolution of 5S ribosomal DNA seems to be driven by birth-and-death processes and selection in "Ensis" razor shells (Mollusca: Bivalvia)

[Abstract] A study of nucleotide sequence variation of 5S ribosomal DNA from six Ensis species revealed that several 5S ribosomal DNA variants, based on differences in their nontranscribed spacers (NTS), occur in Ensis genomes. The 5S rRNA gene was not very polymorphic, compared with the NTS region. The phylogenetic analyses performed showed a between-species clustering of 5S ribosomal DNA variants. Sequence divergence levels between variants were very large, revealing a lack of sequence homogenization. These results strongly suggest that the long-term evolution of Ensis 5S ribosomal DNA is driven by birth-and-death processes and selection

Analysis of ITS1 and ITS2 sequences in "Ensis" razor shells: suitability as molecular markers at the population and species levels, and evolution of these ribosomal DNA spacers

[Abstract] Internal transcribed spacer 1 and 2 (ITS1 and ITS2) sequences were analysed in Ensis razor shells (Mollusca: Bivalvia: Pharidae). We aimed to (1) test ITS1 and ITS2 as molecular markers at the population level in the successful alien E. directus (Conrad, 1843); (2) test these spacers at the species level in E. directus and three other Ensis species, E. siliqua (L., 1758), E. macha (Molina, 1782), and E. magnus (Schumacher, 1817); and (3) analyse the evolutionary processes that may be shaping Ensis ITS1 and ITS2 extant variation. In E. directus, despite the intragenomic divergence detected, ITS1 and ITS2 were informative in differentiating the geographic areas considered (Denmark and Canada) by means of both the insertion-deletion polymorphism and the nucleotide polymorphism. In this species, the 5.8S ribosomal gene (5.8S) showed scarce polymorphism. At the species level, maximum parsimony and maximum likelihood analyses revealed that ITS1 and ITS2 may be suitable to reconstruct Ensis phylogenetic relationships. Finally, the evolutionary models that best fit the long-term evolution of Ensis ITS1–5.8S–ITS2 are discussed. A mixed process of concerted evolution, birth-and-death evolution, and selection is chosen as an option that may reconcile the long-term evolution of Ensis ITS1–5.8S–ITS2 and 5S ribosomal DNA

Population genetic analysis of "Ensis directus" unveils high genetic variation in the introduced range and reveals a new species from the NW Atlantic

[Abstract] We report current genetic variation of populations of the razor shell Ensis directus (Conrad 1843) (Mollusca: Bivalvia: Pharidae) in native (North American) and introduced (European) ranges using nuclear and mitochondrial sequence-based markers. We expected less variation within the introduced range, especially considering the frequent mass mortality events observed in Europe since the species was recorded for the first time in 1978. However, we found higher variation in Europe. The possible significance of temporal fluctuations of genetic variation, limited effect of random genetic drift, and multiple introductions are discussed. Interestingly, the multiple-introduction hypothesis contrasts with the gradual colonisation of European coastal waters but is supported by trained clustering analysis and by the intensity of transatlantic shipping. Genetic and morphometric evidence strongly supports that examined individuals from a supposed E. directus population from Newfoundland (Canada) belong to a separate species. This new Ensis is formally described here and named E. terranovensis n.sp

Cytogenetic characterisation of the razor shells "Ensis directus" (Conrad, 1843) and "E. minor" (Chenu, 1843) (Mollusca: Bivalvia)

[Abstract] The European razor shell Ensis minor (Chenu 1843) and the American E. directus (Conrad 1843) have a diploid chromosome number of 38 and remarkable differences in their karyotypes: E. minor has four metacentric, one metacentric–submetacentric, five submetacentric, one subtelocentric and eight telocentric chromosome pairs, whereas E. directus has three metacentric, two metacentric–submetacentric, six submetacentric, six subtelocentric and two telocentric pairs. Fluorescent in situ hybridisation (FISH) using a major ribosomal DNA probe located the major ribosomal genes on one submetacentric chromosome pair in both species; FISH with a 5S ribosomal DNA (5S rDNA) probe rendered one chromosomal (weak) signal for E. minor and no signal for E. directus, supporting a more dispersed organisation of 5S rDNA compared to the major ribosomal genes. The vertebrate telomeric sequence (TTAGGG)n was located on both ends of each chromosome, and no interstitial signals were detected. In this work, a comparative karyological analysis was also performed between the four Ensis species analysed revealing that the three European species studied so far, namely E. minor, E. siliqua (Linné 1758) and E. magnus Schumacher 1817 show more similarities among them than compared to the American species E. directus. In addition, clear karyotype differences were found between the morphologically similar species E. minor and E. siliqua.Ministerio de Educación y Ciencia; CTM2007-28919-E/MA

Species delimitation and DNA barcoding of Atlantic Ensis (Bivalvia, Pharidae)

[Abstract] Ensis Schumacher, 1817 razor shells occur at both sides of the Atlantic and along the Pacific coasts of tropical west America, Peru, and Chile. Many of them are marketed in various regions. However, the absence of clear autapomorphies in the shell and the sympatric distributions of some species often prevent a correct identification of specimens. As a consequence, populations cannot be properly managed, and edible species are almost always mislabelled along the production chain. In this work, we studied whether the currently accepted Atlantic Ensis morphospecies are different evolutionary lineages, to clarify their taxonomic status and enable molecular identifications through DNA barcoding. For this, we studied 109 specimens sampled at 27 sites, which were identified as belonging to nine of those morphospecies. We analysed nucleotide variation at four nuclear (18S, 5.8S, ITS1, and ITS2) and two mitochondrial (COI and 16S) regions, although the 18S and 5.8S regions were not informative at the species level and were not further considered. The phylogenetic trees and networks obtained supported all morphospecies as separately evolving lineages. Phylogenetic trees recovered Ensis at each side of the Atlantic as reciprocally monophyletic. Remarkably, we confirm the co-occurrence of the morphologically similar E. minor (Chenu, 1843) and E. siliqua (Linné, 1758) along the NW Iberian coast, a fact that has been often overlooked. In South America, a relevant divergence between E. macha (Molina, 1792) individuals from Chile and Argentina was unveiled and suggests incipient speciation. We also confirm the occurrence of the North American species E. directus (Conrad, 1843) as far south as north-eastern Florida. Among the genomic regions analysed, we suggest COI as the most suitable DNA barcode for Atlantic Ensis. Our results will contribute to the conservation and management of Ensis populations and will enable reliable identifications of the edible species, even in the absence of the valves. The name Ensis coseli Vierna nom. nov. is proposed to replace E. minor Dall, 1899 non (Chenu, 1843)